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요약 본 발명은 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 된장 및 그 제조방법에 관한 것으로 바실러스 속 PM3(Bac
illussp. PM3, 생명공학연구소 1990년 5월 23일 기탁번호 KCTC 8486P)로 대두를 발효시켜 제조한 된장은 정상 세
포주에는 유해한 영향을 미치지 않으면서 인간 간암세포주에 대해서만 선택적으로 세포독성을 나타내는 뛰어난 효과가
있다.
대표도
도 1
색인어
된장, Bacillus sp. PM3, 선택적 세포독성, 간암,
명세서
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 간암세포주 HepG2(A)와 정상 간세포주 CCL-13(B)에 대한 바실러스 속(Bacillussp.) 균주에 의해 발
효된 된장 추출물의 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다.
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공개특허 특2001-0076535
도 2는 인간 간암세포주 HepG2(A)와 정상 간세포주 CCL-13(B)에 대한 재래식 된장 추출물의 세포독성 효과를 나타
낸 그래프이다.
도 3은 인간 간암세포주 HepG2(A)와 정상 간세포주 CCL-13(B)에 대한 시판 된장 추출물의 세포독성 효과를 나타낸
그래프이다.
도 4는 표준배지(A)와 PM3를 함유한 배지(1mg/㎖, B)내에서 인간 간암세포주HepG2의 형태를 위상차 현미경을 촬
영한 사진도이다.
도 5는 표준배지(A)와 PM3를 함유한 배지(1mg/㎖, B)내에서 정상 간세포주 CCL-13 의 형태를 위상차 현미경을 촬
영한 사진도이다.
도 6은 정상 간세포주 CCL-13 와 인간 간암세포주 HepG2의 성장에 미치는 된장 추출물의 영향을 나타낸 그래프이다.
발명의 상세한 설명
발명의 목적
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
본 발명은 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 된장 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발
명은 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 바실러스 속 PM3(Bacillussp. PM3; 생명공학연구소 1990년 5
월 23일 기탁번호 KCTC 8486P)에 의해 발효된 된장 및 그 제조방법에 관한 것이다.
된장은 콩을 발효시킨 전통식품으로 한국에서는 중요 영양원이다. 종래 많은 연구자들은 된장을 단백질, 지방 및 탄수
화물의 농도와 같은 영양학적 측면과 관련하여 연구하였다. 그러나 이제는 생물학적 활성의 이해를 바탕으로 건강학적
인 측면에서 다양한 전통식품 연구가 집중되고 있으며 특히, 된장이 바로 그것이다. 따라서, 된장 추출물을 항암성(Ch
ung, K. -S., K., -D. Yoon, D. -J, S. -S. Hong and S. -Y. Choi. 1997.)항돌연변이성(Hong, S-S., K. -S. C
hung, K.-D. Yoon, and Y. -J. Cho. 1996., Shamsuddin, A, M., A. M., Elsayed, and A. Ullah. 1998., Yoon,
K. -D., D. -H. Lee,S. -N. Park, T. -B. Choe, and J. -K. Park. 1997.), 항산화성(Kim, J. -Y., Y. -S. Mae
ng, and K. -Y. Lee. 1995., Lee, J. -S. and H. -S. Cheigh. 1997.), 항고혈압성(Hwang, J. -H. 1997., Shin,
Z. -I., C. -W. Ahn, H.-S. Nam, H.-J. Lee, H.-J. Lee, and T.-H. Moon. 1995., Yu, R., S.-A. Park,D.-K.
Chung, H.-S. Nam, and Z.-I.Shin. 1996.)과 콜레스테롤 저하와 같은 다양한 약효의 기능적 분야내에서 연구하고
있다.
상기 연구분야들 중, 대부분은 암발생 및 암세포 성장 저하에 집중되어 있으며 몇가지 보고에 의하면 대두의 항발암 효
과는 프로테아제 저해제, 페놀 화합물, 피트산 및 대두 이소플라빈에 기인한다고 하였다. 이들 생물학적 활성 물질들은
정상세포 뿐만 아니라 암세포에서 유해한 영향을 미치는 암에 대한 현재의 화학요법의 단점을 극복할 수 있다.
그러나, 본 발명자들은 된장의 생물학적 활성을 연구하면서 몇가지 문제점을 발견하였다. 된장은 발효산물이며 게다가,
아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 바실러스(Bacillus) 등과 같은 많은 미생물이 발효과정에 관
여하며 품질의 차이와 생물학적 활성에도 각각 영향을 미친다(Lim, J.-S. and H.-S. Cheigh. 1997.)).
따라서, 본 발명자들은 된장으로부터 바실러스 속 PM3(생명공학연구소 1990년 5월 23일 기탁번호: KCTC 8486P)와
전통적인 한국식 재래간장으로부터 바실러스 속 SS9(생명공학연구소 1990년 5월 23일: 기탁번호 KCTC 8487P) 및
바실러스 속 SSA3(생명공학연구소 1990년 5월 23일: 기탁번호 KCTC 8488P)를 분리하였으며 상기 각각의 균주를
개별적으로 사용하여 대두를 발효시키므로써 결과산물 즉, 독특한 향과 맛을 내는 된장을 제조하였다. 상기 된장들 중
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바실러스 속 PM3와 바실러스 속 SS9로 발효시킨 된장은 이미 국내에 특허등록(제 55542 호)되어 있다. 상기 된장은
조리된 대두를 35℃에서 3일동안 각 균주를 사용하여 전배양하였고 12NaCl을 함유하는 물을 전배양한 대두에 첨가하
고 이를 상온에서 2달동안 배양하여 제조하였다.
상기 균주 중 간장으로부터 분리한 바실러스 속 SSA3은 신규한 색소를 생산하고 이들 색소는 아플라톡신 B 1 과 인간
간암세포(HepG2)에 대한 저해활성이 있다(Kim, J.-K., O.-S. Shin, and S.-J. Lee. 1995., Kim, J.-K., S.-M.
Park, and S.-J. Lee., 1995.)
일반적으로, 생물학적 활성 물질의 항암효과는 암세포 자체의 저해에만 집중되었다. 이는in vitro항암효과에 대한 결과
를 잘못 이해하여 발생한 것으로 비발암성 세포 성장 저해의 가능성이 있는 것이다. 따라서, 암세포를 선택적으로 성장
저해하는 생물학적 물질의 연구가 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 바실러스 속 균주로 발효시켜 제조된 이미 특허 받은 상기 된장이in vitro에서 인간 간암세포주 HepG2
(Hepatocellular carcinoma)와 정상 세포주 CCL-13(monotypic hepatocyte) 각각에 미치는 세포독성 효과를 조사
하고 이 결과를 재래 된장과 시판 된장과 비교하므로써 상기 된장이 생물학적 물질로 작용하여 선택적 항암성을 나타냄
을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다. 즉, 바실러스 속 PM3 균주를 사용하여 발효시킨 된장은 맛, 향 및 색감이 우수
하고 발효가 단기간에 이루어지며 제품을 규격화할 수 있는 것으로 국내 특허등록( 제 55542 호)되었으나 상기 된장
이 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타낸다는 보고는 없었으므로 본 발명자들은 상기 된장이 인간 간암세포주
에 선택적 세포독성을 나타내는 새로운 건강식품으로써의 용도를 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바실러스 속 PM3(Bacillussp. PM3; 생명공학연구소 1990년 5월 23일 기탁번호 KCTC 8486P)로
발효시켜 제조한 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 된장을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기
된장의 제조방법을 제공함에 있다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
본 발명의 상기 목적은 바실러스 속 PM3, 바실러스 속 SS9 및 바실러스 속 SSA3를 각각 발효균주로 사용하여 제조한
된장의 인간 간암세포주인 HepG2와 정상 간세포주인 CCL-13에 대한 세포독성 효과와 전통 재래식 된장 및 시판 된
장의 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포주인 CCL-13에 대한 세포독성 효과를 각각 조사하여 비교한 결과, 본 발
명 바실러스 속 PM3를 발효균주로 사용하여 제조한 된장이 인간 간암세포주 HepG2에 대해 선택적 세포독성을 나타냄
을 확인하므로써 달성하였다.
발명의 구성 및 작용
본 발명은 바실러스 속 PM3, 바실러스 속 SS9 및 바실러스 속 SSA3로 조리한 대두를 발효시켜 제조한 된장 3종과 대
조구로 사용할 재래식 된장 3종 및 시판 된장 3종을 각각 준비하고 상기 9종의 된장들을 각각 열수추출하여 추출물을
준비하는 단계; 상기 준비한 9종의 된장 추출물을 인간 간암세포주로부터 유래한 HepG2 와 정상 간세포주인 CCL-1
3에 각각 처리하고 배양하여 생존 저해능을 측정하므로써 선택적 세포독성을 조사하는 단계; 된장 추출물 PM으로 처리
하고 배양한 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포주 CCL-13의 형태변화를 자동 사진용 현미경 시스템으로 관찰하
여 세포파괴 정도를 측정하므로써 선택적 세포독성 효과를 조사하는 단계 및; 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포
주 CCL-13에 된장 추출물 PM을 수시로 추가하면서 8일 동안 배양한 후 세포의 성장을 혈구계를 사용하여 측정하므
로써 선택적 세포독성 효과를 조사하는 단계로 구성된다.
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본 발명에서 사용한 세포주는 인간 간암세포주로부터 유래한 HepG2(ATCC No. HB-8065)와 정상 간세포주인 CCL
-13(ATCC No. CCL-13)이며 세포주들은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma Co., U.S.A)내
에서 단층으로 성장시켰으며 5FBS를 추가하였다. 세포를 37℃의 5CO2 배양기(VS-9011C, Vision Scientific Co.,
Korea)에서 보존하였다.
본 발명에서 사용한 된장은 한국 대두를 바실러스 속 PM3, 바실러스 속 SS9 및 바실러스 속 SSA3를 사용하여 발효시
킨 실험군 3종과 가정에서 제조한 대조군으로 재래식 된장 3종은 한국 여수의 관문동(DTY), 광무동(DTG), 공화동(
DTK)에서 수집하였으며 시판된장 3종 DCM(제품명 : 재래식된장), DCD(제품명 : 동원양반 순된장), DCS(제품명 :
청정원순창된장)는 각각 매일식품공업(주), 복천식품(주), 화영식품(주)로부터 구입하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시
예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 된장 제조 및 추출물 준비
조리된 대두에 바실러스 속 PM3 균주를 첨가하고 35℃에서 3일 동안 전배양한 후 12NaCl을 함유하는 물을 첨가하고
상온에서 2달 동안 배양하여 된장을 제조하였다. 같은 방법으로 바실러스 속 SS9 균주 및 바실러스 속 SSA3 균주를
사용하여 각각 된장을 제조하였다. 제조한 된장에 10배 부피의 열수(100℃)를 가하고 30분 동안 추출하였다. 추출물
은 와트만 No.4의 여과지로 여과하였으며 각 추출물을 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상등액을 투석, 동결
건조한 후 -20℃에서 보관하였다. 상기 추출과 동일한 방법으로 재래식 된장 DTY, DTG, DTK와 시판 된장 DCM, D
CD, DCS로부터 열수추출물을 얻었다. 바실러스 속 PM3를 사용하여 발효시킨 된장의 열수추출물을 PM3, 바실러스 속
SS9 균주를 사용하여 발효시킨 된장의 열수추출물을 SS9, 바실러스 속 SSA3 균주를 사용하여 발효시킨 된장의 열수
추출물을 SSA3로 명명하였으며 재래식 된장의 열수추출물은 각각 DTY, DTG, DTK로 명명하였고 시판 된장의 열수
추출물은 DCM, DCD, DCS로 명명하였다.
실험예 1: 세포주 생존저해능에 따른 선택적 세포독성
본 실험에 사용하는 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포주 CCL-13와 같은 점착성 세포를 트립신-EDTA 용액으
로 처리하여 단일세포로 분산시키고 조직배양접시(10×35mm, Falcon Co., U.S.A)에 넣었다. 각각의 배양접시는 2㎖
배지내에 세포 1×105 를 함유하였으며 이를 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 신선한 배지와 함께 상기 실시
예 1에서 준비한 3종의 바실러스 속 균주로 발효시킨 된장 추출물, 재래식 된장 추출물 및 시판 된장 추출물을 각각 배
양접시에 추가하였다. 이를 5CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 이 실험을 두 번 반복 실험하였다. 72시간 후 배
지를 배양접시에서 제거하고 배양접시 표면을 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척하였다. 이어서, 세포를
트립신화시킨 후 0.4트리판 블루로 염색하였고 혈구계(hemocytometer)로 계수하였다. 실험결과, 도 1에 바실러스 속
으로 발효시킨 된장 추출물 PM3, SS9, SSA3의 세포독성 효과를 나타낸 바와 같이 인간 간암세포주 HepG2는 PM3
및 SS9가 1mg/㎖보다 적은 양일 경우 더 높은 저해능을 나타냈으나, 정상 간세포주 CCL-13은 3mg/㎖보다 적은 양일
경우 유의성 있는 생존력을 보여주었다. 따라서 된장 추출물은 암세포와 비발암세포 사이에서 선택적으로 작용하였음을
나타냈다.
재래식 된장 추출물 DTY, DTG, DTK의 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포주 CCL-13에 대한 선택적 세포독성
효과는 도 2에 나타낸 바와 같았다. DTY 및 DTK는 인간 간암세포주 HepG2 세포에 대해 높은 저해 효과를 나타냈고
정상 간세포주 CCL-13에 대해서는 낮은 저해 효과를 나타냈다. 그러나, 정상 간세포주 CCL-13에 대한 재래식 된장
추출물의 세포독성은 SS9, SSA3 및 PM3에 비해 높았다. 이는 암세포에 대해 바실러스 균주로 발효시킨 된장의 선택
적 세포독성이 재래식 된장보다 높음을 나타내고 있다. 인간 간암세포주 HepG2와 정상 간세포주 CCL-13에 대한 시
판 된장 DCM, DCD, DCS의 세포독성 효과는 도 3에 나타낸 바와 같이 인간 간암세포주 HepG2에서 DCM, DCD, DC
S가 2mg/㎖ 일 때, 60 ~ 80의 저해효과가 관찰되었지만 정상 간세포주 CCL-13에서는 저해효과가 13미만이었다.
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상기 나타낸 전반적인 결과는 표 1에서 IC50 값으로 나타냈다. IC50 은 50저해 세포 생존율이 요구되는 추출물의 농도
를 나타낸 것이다. 또한 선택비율은 인간 간암세포주 HepG2에 대한 IC 50 값에 대해 정상 간세포주 CCL-13에 대한 I
C50 의 값의 비율로 평가한 것이다. 결과적으로 PM3는 SS9, SS3 및 PM3 중 가장 높은 선택적 세포독성을 나타냈다.
[표 1]
된장 추출물의 항암활성과 선택성 비율
세포주 추출물 세포독성(IC50 , mg/㎖)
바실러스 속 균주에 의해 발효된
된장
재래식 된장 시판된장
SS9 SSA3 PM3 DTY DTG DTK DCM DCD DCS
HepG2 열수 추출물 0.8 5.0 0.2 0.7 3.2 1.1 0.6 1.4 0.9
CCL-13 열수 추출물 6.1 12.7 4.1 8.2 2.1 1.9 6.1 6.7 6.9
선택성 비율 7.6 2.5 20.5 11.7 – 1.7 10.2 4.8 7.7
[주] 선택성 비율=”CCL-13″ IC 50 /Hep G2 IC 50
실험예 2: 세포주 형태변화에 따른 선택적 세포독성
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 준비한 바실러스 속 PM3 균주로 발효시킨 된장 추출물에 의한 인간 간암세포주
HepG2와 정상 간세포주 CCL-13의 형태 변화를 관찰하기 위해, 1×10 5 cells/㎖을 조직 배양접시에 접종하고 24시간
동안 배양접시 상에 정착시켰다. 배양 배지내 된장 추출물 PM3 1mg/㎖을 접시내 추가하였다. 72시간 배양 후 배지를
제거하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 착색하기 위해 0.5크리스탈 바이올렛과 40에탄올을 함유하는 P
BS 용액으로 처리하였다. 착색 후 세포를 PBS로 세척하고 자동 사진용현미경 시스템 (photomicrographic system;O
lympus, PM-20, Japan)을 사용하여 사진촬영을 하였다. 실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 PM3는 정상 간세포주
CCL-13의 세포를 파괴하지 않았으며 인간 간암세포주 HepG2 세포는 도 4에 나타낸 바와 같이 성장하지 않았으며 자
연스럽게 완전히 분해되었다.
실험예 3: 세포주 성장에 따른 선택적 세포독성
인간 간암세포주 HepG2(Hepatocellular carcinoma)와 단일세균 친화성의 간세포주 CCL-13(monotypic hepatoc
yte)을 배지와 함께 조직 배양 접시에 각각 접종하였다. 된장 추출물을 배양 접시에 추가하고 수시로 배지를 교환하면
서 세포를 8일동안 배양하였다. 상기 배지는 된장추출물을 함유하는 신선한 배지로 100교환하였다. 표준배지 및 된장
추출물을 함유하는 배지에서 세포의 성장은 혈구계를 사용하여 측정하였다. 실험결과, 두 세포주의 성장 곡선은 도 6에
나타낸 바와 같았다. 표준 배지내 정상 간세포주 CCL-13의 성장은 PM3를 함유하는 배지내 정상 간세포주 CCL-13
의 성장과 유사하였다. 이에 반해 PM3를 함유하는 배지에서 인간 간암세포주 HepG2의 성장은 유의적으로 억제하였다.
6일째 까지, 인간 간암세포주 HepG2는 유도기(lag phase)를 보여주었다.
발명의 효과
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 바실러스 속 PM3로대두를 발효시켜 제조한 된장은 정상 세포
주에는 유해한 영향을 미치지 않으면서 인간 간암세포주에 대해서만 선택적으로 세포독성을 나타내는 뛰어난 효과가
있으므로 생물의약 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
(57) 청구의 범위
청구항 1.
바실러스 속 PM3 균주(생명공학연구소 1990년 5월 23일 기탁번호 KCTC 8486P)로 대두를 발효시키는 것을 특징으
로 하는 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 된장의 제조방법.
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청구항 2.
제 1 항 기재의 방법에 의해 제조된 인간 간암세포주에 선택적 세포독성을 나타내는 된장.
도면
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