한국콩연구회

VIGS 시스템을 이용한 콩 유용 유전자 대량 발굴

High throughput gene discovery in soybean by virus-induced gene silencing (VIGS) system

주관연구기관 : 국립식량과학원

연구책임자 : 문중경

발행년월 : 2015-02

주관부처 : 농촌진흥청

원문

http://www.ndsl.kr/ndsl/commons/util/ndslOriginalView.do?dbt=TRKO&cn=TRKO201500010521&rn=&url=&pageCode=PG18

초록

Virus-induced gene silencing (VIGS) is generally considered as an effective tool for functional analysis of genes in plants. However, only a few VIGS vectors such as Bean pod mottle virus, Cucumber mosaic virus, and Apple latent spherical virus were mainly used to study gene function in soybean. Thus, it is necessary to find appropriate and various virus vectors to apply for the VIGS system. VIGS system derived from the soybean yellow common mosaic virus (SYCMV) was developed and tested its ability to silence endogenous genes (phytoene desaturase and small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase). Plants infiltrated with each vector through Agrobacterium-mediated inoculation showed distinct symptoms such as photo-bleaching and yellowing or pale green in soybean. In addition, flowering related genes (E2, E3, and E4), and several unknown genes in soybean. SYCMV-VIGS system showed so effective tool for the gene fuction studies. For the improvement of VIGS system based on SYCMV,

we developed not only the gateway system for the insertion of target gene into the virus RNA, but also, library come from the leaf tissue of cultivar Williams 82. Efficiency of inoculation by SYCMV-VIGS and SYMMV-VIGS dependent on viral replication and systemic movement, We report the findings of VIGS optimization using the SYMMV and SYCMV in measuring silencing efficiencies among plants grown under four different growing temperatures and evaluating soybean cultivars using the real-time PCR. We determined that a higher daytime temperature of 24℃ provided an environment that induced stronger gene silencing than 18 ℃, 21 ℃ and 27 ℃ daytime temperatures. And we identified about one hundred of soybean cultivars, VIGS efficiency were divided into four groups based on soybean VIGS phenotype. In the metabolomic aspect of seeds regulated by down-legulated with target gene, the accuracy and precision of the proposed analytical methods for targeted metabolites were validated by the LOQ(limit of quantitation)

and reproduction test, and the coefficients of variation were all less than 3%. A confirmatory method using LC/MS technique was also provided to clearly identify the targeted metabolites. The proposed analytical methods of targeted metabolites in soybean seeds were sensitive, reproducible and easy-to-operate enough to routinely determine the contents and profiles of targeted metabolites response in various soybean seeds.

연구개발 결과

SYCMV를 이용한 콩 VIGS 시스템은 접종 후 저온처리가 필요치 않았으며, 처리 후 온도가 높을수록 목표유전자의 발현저감 효과가 높은 우수한 VIGS 벡터임을 확인하였고, 품종별 반응양상도 상세히 조사하였다. 또한 기 보고된 유전자 및 임의 유전자에 대한 유전자 발현 저감에 따른 농업형질이 변동되는 것을 확인하였고, 특히, 개화유전자 등의 유전자에 대해서 그 효용성을 확인한 결과, 2주 정도 빨리 개화하였고, 이들 개화에 반응하는 관련 네트워크 유전자 약30점을 확인하였고, 얻어진 종자의 대사체에서도 주로 몇몇 지질 화합물의 대사체가 통계적으로 유의하게 차이가 남을 확인하였다. 또한 임의 유전자에 대한 발현저감 효과를 여러 가지 스트레스 처리 조건(한발, 염해, 습해 등)과 포장조건에서 형태적으로 변동되는 유전자의 발현저감 효과를 확인하여 SYCMV를 이용한 콩 유전자 기능분석이 가능함을 확인하였다. 잎과 꼬투리에서 발현되는 유전자 풀을 구축하였고, 이들 library를 이용하여 보다 효율적인 유전자 기능검색 기반을 구축하였다. 또한 콩 대사체에 대한 정밀한 분석조건을 확립하여 종실에서 유전자의 기능이 변화된 경우, 매우 상세히 변동성을 확인할 수 있는 시스템을 개발하였다. 또한 대사체 연구를 위한 최적 분석 SOP 를 개발하여 타 작물 대사체 연구에서도 활용이 가능하도록 하였다.