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다시마를 함유하는 전통 된장, 그의 제조방법 및 그의에탄올 추출물
요약 항암성, 항돌연변이성이 증진된 기능성 된장. 본 발명의 된장은 전통적인 된장에 다시마를 함유시킴으로써, 무기물 함량이 증가되고, 항암성, 항돌연변이성과 같은 생리활성 기능이 증진된 기능성 건강 식품이다. 또한, 이러한 다시마 함유 전통 된장의 제조방법과 에탄올 추출물도 함께 제공된다.
대표도
도 1
색인어
전통 된장, 다시마
명세서
도면의 간단한 설명
등록특허 10-0544683
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도 1은 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA100 균주에 있어서 MNNG (0.4μg/플레이트)에 대한 된장 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 그래프. (●: 대조군 (무첨가), ○: 5% 다시마 첨가, ▼: 10% 다시마 첨가, ▽: 15% 다시마 첨가)
도 2는 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA98 및 TA100 균주에 있어서 4NQO (0.15μg/플레이트)에 대한 된장 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 그래프. (●: 대조군 (무첨가), ○: 5% 다시마 첨가, ▼: 10% 다시마 첨가, ▽:15% 다시마 첨가)
도 3은 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA98 및 TA100 균주에 있어서 B(α)P (10μg/플레이트)에 대한 된장 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 그래프. (●: 대조군 (무첨가), ○: 5% 다시마 첨가, ▼: 10% 다시마 첨가, ▽: 15%다시마 첨가)
도 4는 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA98 및 TA100 균주에 있어서 Trp-P-1 (0.5μg/플레이트)에 대한 된장 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 나타낸 그래프. (●: 대조군 (무첨가), ○: 5% 다시마 첨가, ▼: 10% 다시마 첨가, ▽:15% 다시마 첨가)
도 5는 인간의 정상세포인 293에 대한 된장 에탄올 추출물의 성장 억제 효과를 나타낸 그래프. (□: 대조군 (무첨가), ▨ :5% 다시마 첨가, ▩ : 10% 다시마 첨가, ▧ : 15% 다시마 첨가)
도 6은 다시마 분말을 첨가한 된장의 에탄올 추출물의 인간 폐암세포 A549에 대한 저해효과를 나타낸 그래프. (□: 대조군(무첨가), ▨ : 5% 다시마 첨가, ▩ : 10% 다시마 첨가, ▧ : 15% 다시마 첨가)
도 7은 인간 간암세포 HepG2에 대한 된장 에탄올 추출물의 성장 억제 효과를 나타낸 그래프. (□: 대조군 (무첨가), ▨ :5% 다시마 첨가, ▩ : 10% 다시마 첨가, ▧ : 15% 다시마 첨가)
도 8은 인간 위암세포 KATO III에 대한 된장 에탄올 추출물의 성장 억제 효과를 나타낸 그래프. (□: 대조군 (무첨가), ▨ :5% 다시마 첨가, ▩ : 10% 다시마 첨가, ▧ : 15% 다시마 첨가) 발명의 상세한 설명
발명의 목적
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
본 발명은 항암성, 항돌연변이원성 등 기능성을 갖는 전통 된장, 그의 제조방법 및 에탄올 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 된장 제조시 다시마를 첨가하여 제조된 된장과 그의 제조방법 및 그로부터의 에탄올 추출물에 관한 것이다.
된장, 고추장을 비롯한 우리나라의 전통식 장류는 우리나라 고유 음식의 맛을 내는 기본이 되는 식품일 뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 지방 등의 영양소가 골고루 들어 있는 콩 발효식품으로서 육류 섭취량이 적었던 전통적인 시절에 단백질 공급원으로서 중요한 위치를 차지하는 영양식이기도 하다.
된장은 특히 최근 항돌연변이원성, 항산화성 등과 같은 생리활성 효과로 성인병 예방은 물론 암을 예방하는 건강식으로서의 기능이 알려져 지대한 관심을 끌고 있다. 또한 전통 된장은 최근 그의 발효특성과 관련하여 영양학적 가치가 새롭게 인식됨에 따라 단순한 일용 식품으로서 뿐만 아니라, 건강 증진을 위한 기능성 식품으로서의 가능성도 제공하고 있다.
이러한 생리활성 효과 중 항암효과는 원료인 콩에서 유래하는 것과 발효과정에서 분해되거나 새롭게 만들어지는 성분에 의해서 나타나는 것으로 추정되고 있다. 대두에서 유래하는 항암활성 물질로는 프로테아제 억제제 (Kennedy A.R. 외 Cancer Res 43: 2454s-2459s, 1981; Yavelow J. 외, Cancer Res 43: 2454s-2459s, 1983; St Clair 외, Cancer Res 50: 580-586, 1990 참조), 피트산 (Shamsuddin A.M. 외, Carcinogenesis 10: 1461-1463, 1989; Shamsuddin A.M. 외, Carcinogenesis 9: 577-580, 1988 참조)및 이소플라본 (Tiisala S. 외, Biochim. Biophys Res Commum 203: 443-449, 1994; Okura A. 외, Biochim. Biophys Res Commum 157: 183-189, 1988; Peterson G. 외, Biochim. Biophys 등록특허 10-0544683
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Res Commum 179: 661-667, 1991 참조)등이 보고되고 있으며, 특히 제니스테인을 비롯한 대두 이소플라본 성분의 항
암효과에 대한 연구는 현재도 큰 관심 속에서 진행되고 있다 (Messina M. 외, J Am Diet Assoc 91: 836-840, 1991 참
조). 이와 같이 최근, 전통 식품을 좀 더 현대인의 소비자 기호에 맞게 변형시키려는 노력 이외에 여러가지 기능성 소재를 첨가하여 그 기능성을 향상시키는 연구가 진행되고 있다.
한편, 다시마 (Laminaria longissima)는 갈조류에 속하는 다시마과의 한 속으로서 한국, 일본 및 중국 등의 극동 아시아 지역에 서식하며, 독특한 맛과 향으로 기호성이 양호하여 각종 음식물의 주, 부재료로 널리 사용되고 있다 (Ito K., Tsuchiya Y., In Proc. of 7th Int. Seaweed Symp. Nishizawa K. Univ. Tokyo Press, Japan, . 558-561, 1972 참조). 또한, 갈조류 중에는 중성다당인 라미나란 (laminaran)과 황산기를 함유한 산성다당이 다량 함유되어 있으며, 그 대표적인 것이 함황산성 다당인 푸코이단 (fucoidan)과 알지네이트 (alginate)이다 (Kim D.S. 외, J. Korean Fish Soc. 18: 29-36, 1985 참조). 이제까지 된장에 녹차, 버섯 등을 첨가한 식품은 알려진 바 있지만, 된장과 다시마 성분을 접목시킨 식품에 대해서는 전혀 체계적인 연구가 이루어지지 않았다. 발명이 이루고자 하는 기술적 과제
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 상기한 바와 같은 전통 된장과 다시마의 기능에 주목하여, 최적의 조건으로 다시마를 이용함으로써 영양학적 특성뿐만 아니라, 항암, 항돌연변이성 등 생리학적 기능이 증대된, 다시마가 첨가된 전통 된장을 제공하는 데 있다.
즉 본 발명의 한가지 목적은 다시마의 독특한 기능성, 맛 성분과 우리나라 전통 된장의 영양 및 기능성이 조화됨으로 해서, 소비자의 기호와 상품성을 만족시키는 다시마가 첨가된 전통 된장을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바와 같은 다시마가 첨가된 전통 된장의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바와 같은 다시마가 첨가된 전통 된장의 에탄올 추출물을 제공함으로써 유용 생리활성 물질로서의 이용 가능성을 증대시키는 데 있다.
본 발명의 기타 목적은 이하의 설명으로부터 더욱 명확해 질 것이다. 발명의 구성 및 작용
상기한 목적을 달성하기 위해 집중적으로 연구한 결과 본 발명자들은 숙성 단계에서 전통 된장에 다시마를 2 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 3 내지 7 중량%, 특히 5 중량%의 양으로 함유시킬 경우, 된장의 항암, 항돌연변이성 등 생리학적 기능을 상승시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 더욱 구체적으로 본 발명의 다시마 된장은 메주, 보리밥, 소금 및 다시마를 중량%로 50:25~33:15:2~10의 비율로 혼합하여 3 ~ 6개월간 숙성시킴으로써 얻어진다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 된장은 다음과 같이 제조하였다. 그러나, 지방마다 된장의재료와 발효조건 등의 차이가 있음을 감안할 때, 본 발명에 사용가능한 된장이 반드시 하기의 제조방법에 의해 얻어진 것으로 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명할 것이다. 재료
본 발명에 사용된 다시마는 강원도 고성군 2000년산을 사용하였으며 다시마를 직접 분쇄하여 80매쉬 채로 사별하여 사용하였다. 그러나, 본 발명의 다시마 함유 된장에 첨가되는 다시마의 성상이 이와 같은 분말에 한정되는 것은 아니며 다시마 추출물 등 다양한 유형의 다시마를 사용할 수 있다. 한편, 된장의 주원료인 메주, 보리, 소금 등은 시판되는 것을 이용하였다.
된장은 아래와 같이 전통적인 자연발효법에 따라 제조하였다.
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된장의 제조
잘 띄워 햇볕에 마짝 말린 메주를 선별하여 된장 재료로 사용하였다.
깨끗한 항아리에 잡균을 제거한 메주를 메주가 뜰 정도로 농도를 맞춘 소금물에 넣고 대나무 등으로 눌러서 메주가 뜨지 않게 눌러놓은 후 장 담그는 시기에 따라 40일에서 70일간 익힌다. 이 때 불순물을 제거하고 잡균번식을 막기 위해 숯과 마른 붉은 고추를 넣어두며, 낮에 항아리 뚜껑을 열어 햇볕을 충분히 쬐게 한다. 발효가 완료되면, 메주와 된장을 가른다.
다시마 함량 5 중량%가 되도록 할 경우, 메주에 보리밥, 소금 및 다시마 분말을 중량%로 50:30:15:5의 비율이 되도록 첨가하여 잘 버무린다. 잘 버무려진 된장을 항아리에 담고 가끔식 뒤집어 주면서 3 ~ 6 개월간 숙성시켜 본 발명에 따른 다시마가 첨가된 된장을 제조하였다. 최적 효과를 나타내는 다시마 분말의 첨가량을 알아보기 위해, 다시마 분말을 10% 및 15%의 양으로 달리 하여서도 다시마 된장을 제조하였다. 이 경우, 다시마의 양을 10%와 15%로 증가시킨 만큼, 보리밥의 함량을 각각 25%와 10%로 감소시켰다.
이렇게 제조된 다시마 된장의 생리활성 기능은 다음의 방법으로 제조한 각각의 에탄올 추출물을 이용하여 시험하였다.
에탄올 추출물의 제조
상기한 바와 같이 제조된 다시마 된장에 10배의 70% 에탄올을 첨가하고 80℃에서 8시간씩 3회 추출하였으며, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태로 여과시킨 후 감압농축하여 추출용매를 제거한 후 동결건조기를 이용하여 건조시켜 실험에 사용하였다. 사용된 추출용매인 에탄올은 특급시약을 사용하였다.
상기한 바와 같이 제조된 에탄올 추출물을 이용하여 다시마 된장의 돌연변이원성, 항돌연변이원성 및 세포독성 등의 생리 활성 효과를 실험하였다.
실험에 사용된 시약 및 분석방법을 이하에 상세히 설명한다. 하기 설명 중, 다시마 함량은 중량% 기준이다.
시약 직접 돌연변이원으로서 미국 Sigma사 제품인 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드 (4NQO: 4-nitroquinoline-1-oxide), N-메틸-N’-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG: N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine), 글루코스-6-포스페이트를 이용하였다.
간접 돌연변이원으로는 일본 화광순약사로부터 구입한 특급시약인 벤조(α) 피렌 (B(α)P)과 3-아미노-1,4-디메틸-5H-피리도-(4,3-b)인돌(Trp-P-1), 및 L-히스티딘을 이용하였다.
세포배양에 필요한 배지로는 RPMI 1640과 Hepes 완충액, 소의 태아 혈청 (FBS: fetal bovine serum), 트립신-EDTA를 Gibco사 (USA)로부터 구입하여 사용하였다.
또한 실험에 이용된 인간 폐암세포 A549, 인간 간암세포 HepG2, 인간의 위암세포 KATO III, 및 정상세포 293
(transformed primary human embryonal kidney)은 KCLB (Korea Cell Line Bank)로부터 구입하여 배양하면서 실험에 사용하였다.
1. 일반분석
다시마 된장의 일반성분분석은 AOAC법 (Official methods for analysis, 16th ed. Association of official analytical
chemists, Washington, D.C. CH 27, p. 31, 1995)과 식품공전 (식품의약품안전청 2000, 식품공전 (별책) 문영사, 서울, p. 69-72, p. 273-277)에 따라 3회씩 분석하여 평균값을 구하였다. 즉, 수분은 105℃ 상압건조법, 조회분은 건식회화법, 조지방은 에테르추출법, 조단백질은 킬달법으로 분석하였다. 염분은 AgNO3 적정법으로 분석하였으며, 탄수화물은 100에서 수분, 조회분, 조단백질, 조지방, 염분을 뺀 값으로 하였다. 무기물은 식품공전에 의해 분석하였다.
먼저, 다시마, 메주, 그리고 농도를 달리하여 다시마를 첨가한 다시마 된장 의 일반성분 분석결과 및 미네랄 성분 분석결과를 각각 다음 표 1 및 표 2에 나타내었다.
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[표 1]
[표 2]
상기 표 1의 일반성분 분석 결과가 식품성분표 (농촌진흥청 농업생활연구소 식품성분표, 제 5 개정판, 1996)와 비교하여 볼 때, 약간의 차이가 있는 것은, 수확시기, 재배조건, 기후, 품종, 제조방법 등 여러 조건에 기인하는 것으로 사료된다.
상기 표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 다시마를 각각 5, 10, 및 15 중량%씩 첨가한 다시마 된장의 경우는 다시마 무첨가 된장에 비해 조단백질 함량은 2.5% 이상 감소하였고, 조지방, 및 탄수화물 역시 각각 1.4%와 1.3%씩 감소하였다.
이에 비해, 수분과 염분의 함량은 다시마가 첨가된 된장이 무첨가 된장보다 증가한 것으로 나타났다.
또한, 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 다시마 된장의 무기물 함량은 Fe, Mn, P, Ca, Mg, K의 경우 증가하고, 특히 K의 경우 다시마 무첨가군 된장보다 119.7 mg% 이상 증가한 것으로 나타났으며, Cu와 Zn의 함량은 다시마 첨가군 된장이 다시마 무첨가군 된장에 비해 각각 0.2 mg% 및 0.5 mg%이상 감소한 것으로 나타났다. 2. 돌연변이원성 실험
다시마를 농도별로 첨가한 된장의 돌연변이원성 실험은 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium)의 변이주인 TA98과
TA100을 이용하여 Ames 테스트를 개량한 프리인큐베이션법으로 실시하였다 (Yahagi T. 외, Mutation Res. 48: 121-
130 참조). 건열멸균시킨 유리캡 튜브에 각각의 시료를 50μg/플레이트씩 가하고 여기에 전배양시킨 배양균액 100 μL를 가한 다음, 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4)으로 전체량이 700 μL가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진 등록특허 10-0544683
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탕배양한 다음 히스티딘/바이오틴이 첨가된 톱 아가 (45℃)를 2 mL씩 가하여 잘 혼합한 후 미리 조제해 놓은 최소 글루코스 한천 플레이트 상에 도말하고 평판고정화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이 (his+ revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
테스트 결과 음성대조군의 복귀 돌연변이 집락수는 된장의 경우 TA98이 17 ±3, TA100은 174 ±7이었다. 다시마를 첨가
한 된장의 에탄올 추출물을 50, 100, 150 및 200 μg/플레이트의 여러농도로 하여 실험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않았다. 이로부터 다시마 를 첨가한 된장의 에탄올 추출물은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다 (데이타 생략).
3. 항돌연변이원성 실험
Ames 테스트를 개량한 프리인큐베이션법에 따라 항돌연변이원성 실험을 하였다. 변이원 물질로는 Ames 테스트에서 양성반응을 나타내며, 물질 그 자체로서 돌연변이를 유발하는 직접 변이원물질인 4NQO와 MNNG, 대사활성을 필요로 하는 간접 변이원물질인 B(α)P와 Trp-P-1을 사용하였다. 건열멸균시킨 유리캡 튜브에 각 시료, 즉 다시마 된장의 에탄올 추출물을 50μL씩 첨가한 다음 변이원 물질을 50μL씩 첨가하였다. 간접 변이원인 경우 10% S-9 mix를 250μL씩 첨가하였다.
여기에 전배양시킨 균액을 100 μL씩 주입한 후 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액을 가하여 최종부피가 700μL가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 다시마를을 첨가한 된장의 추출물과 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며 항돌연변이 활성은 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율 (%)로서 나타내었다. 그림에서 나타낸 억제율은 3회 반복실험을 실시하여 평균치를 나타낸 것이다.
억제율 (%) = [(M-S1) / (M-S0) ] X 100
식 중,
M : 돌연변이 물질만 존재한 경우의 복귀 돌연변이 수
S0 : 자연 복귀 돌연변이 수
S1 : 시료를 첨가하였을 때의 복귀 돌연변이 수
분석결과는 다음과 같다.
다시마를 첨가한 된장의 에탄올 추출물의 경우, 식품의 조리과정 중에서 발생하는 강력한 발암물질로써 직접변이원으로 사용된 MNNG (0.4μg/플레이트)의 경우 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA100 균주에서 시료농도 200μg/플레이트에서 5% 다시마 첨가 된장이 97.0%의 높은 억제효과를 나타내었고, 다시마 무첨가군, 10%, 및 15%의 첨가군에서는 각각 89.3%, 83.6%, 그리고 82.1%로 5% 다시마 를 첨가한 된장에 비해 낮은 억제효과를 나타내었다 (도 1).
또한 직접변이원 4NQO (0.15μg/플레이트)에 대한 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA98 및 TA100의 실험결과 역시 두 경우 모두 5% 다시마 분말 첨가 된장이 다른 첨가군 또는 무첨가군에 비해 높은 억제 효과를 나타내었다. 즉, TA98의 경우, 5% 다시마 첨가 된장 에탄올 추출물이 시료농도 200μg/플레이트에서 60.2%를 나타낸데 비해, 무첨가, 10% 및 15% 다시마 첨가 된장 에탄올 추출물은 각각 49.5%, 43.7%, 및 45.8%의 억제율을 나타내었으며, TA100 균주의 경우에도, 5% 다시마 첨가 된장의 경우에는 동일 시료 농도에서 69.1%, 무첨가, 10% 및 15% 다시마 첨가 된장에서는 각 각 53.7%, 63.4%, 및 57.2%의 억제율을 나타내어, 5% 다시마 첨가 농도의 효과가 가장 뛰어남을 알 수 있었다 (도 2).
한편, 마이크로좀 효소의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 폴리사이클릭 방향족 탄화수소인 B(α)P(10μg/플레이트)를 사용한 경우 된장 추출물 (도 3)에서는 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium) TA98, TA100 두 균주 모두에서 시료농도 증가에 따라 억제효과 또한 증가하는 경향을 보였다.
5% 다시마 분말 첨가군에서는 TA98 균주에서 시료농도 200μg/플레이트로 한 경우 다른 첨가군보다 다소 높은 71.7%의 억제율을 나타내었다. TA100의 경우는 5% 다시마 분말을 첨가한 된장이 같은 농도에서 87.3%로 다른 첨가군보다 높은 억제효과를 보였으며, Trp-P-1 (0.15μg/플레이트)에서는 TA98 균주의 경우 시료농도 200 μg/플레이트 농도에서 5% 다시마 첨가군이 66.6%로, 다시마 무첨가, 10%, 및 15% 첨가군은 각각 57.7%, 61.3%, 및 58.1%의 억제효과를 보였다. 또 등록특허 10-0544683
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한, TA100 균주에서는 다시마 5% 첨가군 된장 에탄올 추출물이 시료농도 200 μg/플레이트 농도에서 80.8%의 억제효과
를 보였으며, 동일 농도에서 다시마 무첨가, 10%, 및 15% 다시마 첨가군에서는 각각 63.5%, 71.4% 및 73.8%로 5%의 첨가군보다 약간 낮은 억제율을 나타내었다 (도 4).
이상의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 된장은 그 자체로 어느 정도 항돌연변이원성을 나타내었으나, 다시마 첨가로 더욱 높은 항돌연변이 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이와 같이 다시마 첨가는 된장과의 시너지 효과를 나타내어 더욱 높은 생리활성 효과를 나타내었다.
본 발명에서 된장에 다시마를 첨가함으로써 시너지 효과가 나타난 것은, 다시마의 함황 산성다당인 푸코이단과 알지네이 트 성분 등이 된장의 생리활성 성분과 공동으로 작용한 것으로 생각된다. 또한, 다시마 첨가시 다시마 유래의 식이섬유나 알지네이트, 그리고 푸코이단 등 생리활성 기능을 갖는 성분들과 대두의 생리활성 성분인 이소플라본 등이 발효미생물의 작용으로 각종 성분 상호간의 작용 및 생성된 미지 화합물의 상승 효과를 촉진시켜 주는 것으로 추정된다.
4. 세포독성 실험
암 유발 초기단계에서 돌연변이가 매우 중요한 작용을 하고 대부분의 발암물질이 돌연변이원이라는 공통점은 항돌연변이원성을 나타내는 물질이 항암활성을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 이 실험에서는 다시마를 첨가한 된장의 에탄올 추출물의 각종 암세포에 대한 세포 독성을 규명하고자 한다. 실험은 암세포로서 인간 폐암세포 (A549), 인간 간암세포 (HepG2)및 인간 위암세포 (KATO III)를 이용하고, 정상세포로서 293을 이용하여 다음과 같이 수행하였다.
SRB [sulforhodamine B] 분석은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 (Scudiero,
D.A. 외, Cancer Res., 48, 4827-4836, 1988)으로 10%의 소의 태아 혈청 (FBS)과 각각의 암세포들인 A549, HepG2 및
정상세포 293를 함유한 RPMI 1640 배지를 5 x 104 cell/mL 농도로 100μ씩 각 웰에 참가하여 하루동안 배양 (37℃, 5% CO2) 시킨 후 PBS (포스페이트 완충염수)에 녹인 추출물들은 각각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL씩 첨가하여 다시 48시간 배양시켰다. 그 후 상등액을 아스피레이터로 조심스럽게 제거하고 차가운 10% TCA (트리클로로아세트산, 4℃) 용액을 50μL씩 첨가하여 세포들을 웰 바닥에 고정시켰다. 한시간 동안 4℃에서 배양시킨 후, TCA와 배지들을 제거하기 위하여 증류수로 다섯번 씻어내였다. 플레이트를 건조시키고 여기에 1% 아세트산에 녹인 0.4% SRB를 첨가해서 30분 동안 염샘시킨 후 결합하지 않은 SRB 염색액을 제거하기 위해 1% 아세트산 용액으로 네번 세척하였다. 건조기에서 건조된 플레이트는 10mM 트리스 완충액 100 μL로 염색제를 충분히 녹인 후 540 nm에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.
MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 분석은 세포의 생육 및 분화를 측정하는 방법
(Martin, A. 외, Cytotechnology, 11, 49-54, 1997)으로서 이 실험은 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 데히드로게나 제 (dehydrogenase)가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 암청색 포르마잔을 생성해내는데 착안한 실험이다. 인간의 위암세포 (KATO III)와 10% 소의 태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지를 5 x 104 cell/mL 농도로 각각의 웰에 100 μL씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CO2)시킨 후 각각의 시료를 0.25, 0.50, 0.75 및 1.0 mg/mL 농도로 100 μL씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배양하였다. 여기에 MTT (5μg/μL) 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양시켜 포르마잔을 형성시킨 후 조심스럽게 아스피레이터로 상등액을 제거시켰다. 그리고 DMSO (디메틸 설폭사이드) 150 μL를 첨가하여 포르마잔을 녹인 후 540 nm에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
분석 결과는 다음과 같다.
인간 정상세포 293에 대한 독성 효과는 최고농도 1.0 mg/mL에서 다시마 무첨가군과 첨가군 모두에서 30% 이하의 낮은 억제 효과를 나타내어 정상 세포에 대해서는 안전한 것으로 판단된다 (도 5).
도 6에서는 다시마를 첨가한 된장의 에탄올 추출물의 인간 폐암세포 A549에 대한 저해효과를 나타내었다. 0.5, 0.75, 1.0mg/mL의 농도에서 다시마 5% 첨가군이 다른 첨가군에 비해 약간 높은 36.7%, 42.6%, 그리고 56.4%의 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
한편, 인간 간암세포 HepG2에 대한 억제효과에 있어서는, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL의 시료농도에서 5% 다시마 첨가 된장의 에탄올 추출물이 다시마 무첨가, 10% 및 15% 다시마 첨가 된장의 경우보다 활성이 높은 53.2%, 74.4%, 및 87.6%의 억제효과를 나타내었다(도 7).
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도 8은 인간 위암세포 KATOIII 세포에 대한 다시마 첨가 된장 에탄올 추출물의 암세포 성장 억제효과를 나타낸 것으로,
0.5, 0.75, 1.0 mg/mL 첨가시 다시마 분말을 5% 첨가한 된장이 다른 첨가군에 비해 비교적 높은 55.4%, 78.6%, 90.5%의 암세포 성장 억제효과를 나타내었다.
첨가되는 다시마의 최적 함량은 된장 중량의 2 내지 10 중량%, 바람직하게는 5 중량%인 것이 좋다. 다시마 함량이 2 중량% 미만일 경우 목적하는 항암, 항 돌연변이 효과 등의 생리활성 기능의 상승 효과가 미미하고, 10 중량%를 초과할 경우에도, 상기한 생리활성 기능이 이렇다하게 증가하는 것으로 관찰되지 않았다.
즉, 다시마 무첨가군 및 첨가군에서 HepG2와 KATOIII에 대해 매우 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었으며, 특히 5% 다시마 첨가군에서 유의적 (p<0.05)으로 다른 첨가군보다 높은 억제활성을 나타내어, 다시마 5% 첨가시가 생리활성을 높이는 시너지 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 또한, 시료농도가 0.5 에서 1.0 mg/mL로 증가함에 따라 억제율도 높게 나타나는 것으로 보아 시료농도와 억제율도 상관관계가 있는 것으로 추정된다. 이와 같이, 다시마를 적정 농도로 함유하는 전통 된장의 생리활성 효과가 전통 된장의 원료인 콩 및 콩 관련 식품들의 생리활성과 상승작용을 나타냄을 알 수 있으며, 전통 된장 자체 뿐만 아니라, 그의 에탄올 추출물 유용한 생리활성 물질의 소재로서 사용가능할 것으로 기대된다.
발명의 효과
자연발효법으로 제조한 된장에 적정 농도의 다시마를 첨가하자 대부분의 무기물 함량이 다시마 첨가 전보다 증가하였다. 또한, 항돌연변이 효과 및 암세포 성장 효과 역시 다시마 분말 첨가전보다 증가된 것으로 나타나, 전통 된장에 다시마를 첨가함으로써 전통 된장의 영양학적, 생리학적 기능을 증진시킬 수 있다.
(57) 청구의 범위
청구항 1.
메주, 보리밥, 소금을 주재료로 하는 전통 된장에 다시마를 총 된장 중량에 대해 5 중량%의 양으로 혼합하여 3 ~ 6개월간
숙성시켜 얻는, 다시마를 함유하는 전통 된장.
청구항 2.
제1항에 있어서, 메주 50 중량%, 보리밥 30 중량%, 소금 15 중량% 및 다시마 5 중량%로 구성됨을 특징으로 하는 다시마
를 함유하는 전통 된장.
청구항 3.
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청구항 4.
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청구항 5.
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청구항 6.
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도면
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도면1
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